嗜酸乳杆菌和青春双歧杆菌治疗实验性结肠炎小鼠的作用及其机制
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练光辉 卢放根 陈宏辉 游宇 谭鲜 邱力
【摘要】 目的评价青春双歧杆菌和嗜酸乳杆菌对实验性结肠炎小鼠模型的治疗效果并初步探讨其机制。方法 75只BABL／C小鼠均分为5组并给予相应处理，其中4组为实验组，分别为：青春双歧杆菌BF0624治疗组(B组)、嗜酸乳杆菌LT0637治疗组(L组)、水杨酸柳氮磺胺吡啶治疗组(S组)、0.9％氯化钠对照组(NS组)；另设正常对照组(N组)。实验组小鼠用4％葡聚糖硫酸钠造模，N组则饮用0.9％氯化钠溶液。实验期间每天记录动物体重、大便隐血情况，计算疾病活动指数(DAI)。在第4、6、8天各组各处死5只小鼠，分离结肠，测量其长度，行病理组织学检查，逆转录PCR和Western印迹法分别测定热休克蛋白(HSP)70、糖皮质激素受体(GR)、白细胞介素(IL)-10和肿瘤坏死因子(TNF)-a的基因和蛋白表达。结果 青春双歧杆菌BF0624和嗜酸乳杆菌LT0637能缓解实验性结肠炎小鼠的肠道炎性反应，第3天时L组小鼠DAI积分(1.8土0.4)低于NS组(2.8士1.0)，从第5天开始各治疗组DAI均明显降低。B组、L组、S组第8天时结肠长度分别为(9.0±0.6)、(9.3士0.6)、(8.8士1.1)cm，均大于NS组E(8.1士0.6)cm，P值均<0.05]。第8天时L组小鼠结肠黏膜病理组织学明显改善(组织学评分6.0±1.0)。B组和L组IL-10和HSP70表达上调，TNF-a表达下调，GR无变化。结论青春双歧杆菌BF0624和嗜酸乳杆菌LT0637均对溃疡性结肠炎有治疗作用，益生菌的治疗机制可能与上调HSP70和IL-10以及下调TNF-α的表达有关。
【关键词】溃疡性结肠炎，双歧杆菌；乳酸杆菌
Effects of B．adolescentis and L．acidophilus in treating experimental ulcerative colitis in mice and theirpotential mechanisms LMN Guang-hui*，LU Fang-gen，CHEN Hong-hui，YOU Yu，TAN Xian，QIULi． *Department of Gastroenterology，Xiangya Second Hospital，Changsha 410011，China Corresponding author：LU Fany-gen，Email：lufanggenyao@163.Com
[Abstract] Objective To investigate the effects of B．adolescentis and L．acidophilus in treatment of dextran sulphate sodium(DSS)-induced ulcerative colitis(UC)in mice and their potential mechanisms．
MethodsSeventy-five BABL／C mice were randomly divided into control，saline(NS)，B，adole．scentis BF0624 treatment(B)，L．acidophilus LT0637treatment(L)andsalicylazosulpha-pyridine treatment
(S)groups．Except control group，the other four groupswere received DSS to induce ulcerative colitis．The weight—loss，fecal trait and bleeding were recordedevery day．Colonic length and histological scoreswere evaluated on day 3．5 and 7．The gene and protein expression of hot shock protein(HSP)70，glucoeortieoid receptor(GR)，interleukin(IL)-10 and tumor necrosis factor(TNF)-a were detected by Western blot and reverse polymerase chain reaction(RT-PCR)respectively．Results B．adolescentis BF0624 and L．acdophilus LT0637 could relieve the inflammatory reaction of the experimental UC．The DAI scores were 1.8士0.4 in L group on day 3，which was lower than that in NS group(2.8士1.0)．The DAl scores in all treatment groups were decreased on day 5．Compared with NS group[(8.1 ±0.6)cm]， the colon length on day 8 were(9.0士0.6)cm in B group，(9.3±0.6)em in L group and(8.8士1.1)cm inSgroup(P<O．05)．The colonic mucosa was improved pathohistologicany in Lgroup(6.0±1.0) on day 8．The expression of HSP70 and IL-10 in B and L groups were up-regulated and the expression of TNF二awas down-regulated．ConclusionsBoth B．adolescentis BF0624 and L．acidophilus LT0637 were effective in treatment of acute ulcerative colitis .the potential mechanism of two probiotis may be related with up-regulation of HSP70 and IL-10 expression and down-regulation of TNF-α expression.
【key words】ulcerative colitis；bifidobacterium；lactobacillus
溃疡性结肠炎(UC)是一种反复发作的结肠黏膜慢性炎性疾病,其病因学和发病机制尚不明确，可能与遗传、免疫和肠道菌群有关[1]。近年问世的英夫利昔( (infliximab)单抗及各种生物制剂可有效缓解UC[2],但其对人体免疫功能的影响有待评价。有研究发现,UC患者常有肠道菌群失调[4]。本研究使用青春双歧杆菌和嗜酸乳杆菌治疗实验性结肠炎模型小鼠,分析免疫相关细胞因子、黏膜应激保护相关因子水平及其变化规律,评价益生菌治疗UC的效果，并探讨其可能的作用机制。
材料与方法
1.动物分组及处理:75只8周龄SPF级BALB/C小鼠,平均体重20g,雌雄各半。均分为5组,其中4组为实验组，分别为：青春双歧杆菌治疗组(B组)、嗜酸乳杆菌治疗组(L组)、水杨酸柳氮磺胺毗啶(SASP）治疗组(S组)、0.9%氯化钠对照组(NS组);另设正常对照组(N组)。饲养于标准条件下(湿度50%±10%、12h白昼/12h黑夜轮换)，喂食普通小鼠饲料。实验组小鼠自由饮用4%葡聚糖硫酸钠溶液(DSS,相对分子质量5000 Sigma公司),N组则饮用0.9%氯化钠溶液,各实验组自第1天起每日1次分别给予青春双歧杆菌BF0624(1×109cfu/ml,湖南康哲中南医药研究有限公司)、嗜酸乳杆菌LT0687(1×109cfu/ml,湖南康哲中南医药研究有限公司)、SASP(20g/L,上海福达药物有限公司)、0.9%氯化钠灌胃,每次0.2ml,共7d。N组小鼠不予任何处理。测量动物体重记录类便性状和隐血情况。根据参考文献[5]方法计算疾病‖活动指数(DAI积分,在第4、6、8天早上各组各处死5只小鼠，开腹分离结肠并测量其长度,取部分结肠组织甲醛固定,石蜡包埋切片后H-E染色;其余结肠分两部分液氮保存以备mRNA和蛋白质抽提。计算组织损伤积分。
2.结肠细胞因子检测：Trizol法提取结肠mRNA，按试剂盒说明书进行逆转录，PCR反应条作为：94℃变性30s，60~54℃解链1min，72℃延伸30s。β-actin上游引物：5＇-TCATGAAGTGTGACGTTGACATCCGTAAAG-3＇,下游引物：5＇-CCTAGAAGCATTTGCGGTGCACGATGGAGG-3＇。肿瘤坏死因子（TNF）-α上游引物：5＇-ACGTGGAACTGGCAGAAGAG-3＇,下游引物：5＇-GGTTGTCTTTGAGATCCATGC-3＇。白细胞介素（IL）-10上游引物：5＇-ATGCAGGACTTTAAGGGTTACTTG-3＇，下游引物：5＇-TAGACACCTTGGTCTTGGAGCTTA-3＇。糖皮质激素受体（GR）上游引物：5＇-CAGCCTGGCACCAACGGT-3＇，下游引物：5＇-GGCTTCTGATCCTGCTGCTGG-3＇。热休克蛋白（HSP）70上游引物：5＇-TCACCACCTACTCCGACAAC-3＇，下游引物：5＇-ATGTTGAAGGCGTAGGACTC-3＇。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测。组织裂解法提取结肠组织总蛋白质，Western印迹法检测特定蛋白浓度。
3.统计学分析：采用SPSS10.0软件进行分析，体重变化、结肠长度、DAI积分和组织损伤积分的数据均以±标准差表示，对计量资料先行方差齐性检验，方差齐者行单因素方差分析（one-way ANOVA）,差异有统计学意义者再行两两比较（student-Newman-keuls检验)。P＜0.05为差异有统计学意义。
结果
1.体重改变：实验第1天各组小鼠体重差异无统计学意义（P＞0.05），第3天开始，饮用DSS的小鼠体重下降，但各组间差异无统计学意义（P＞0.05)。L组小鼠体重下降缓慢，自第5天起体重回升，与NS组比较差异有统计学意义（P＜0.05)。B组、SASP组体重持续减轻，但第7天时体重减轻明显少于NS组（P＜0.05)。N组小鼠实验期间体重缓慢增加。见图1。
2.DAI积分:B组、L组和SASP组小鼠DAI积分从第5天起较NS组明显降低，其中L组小鼠于第3天时积分即已显著低于NS组，DAI积分峰值为3．3±0．8。见表1。
3.结肠长度：所有饮用DSS小鼠结肠均出现不同程度的缩短。第8天时NS组、S组、B组、L组、N组的结肠长度分别为(8.1士0.6)、(8.8±1.1)、(9.0±0.6)、(9.3±0.6)、(11.3±1.1)cm，L组明显大于NS组，差异有统计学意义(P>0.05)。
4．组织学评分：NS组小鼠结肠黏膜缺损、隐窝破坏、黏膜出血、炎性细胞浸润。第6天时B组，L组和S组组织病理学改善不明显，仅黏膜组织间炎性细胞浸润减少。第8天时L组小鼠组织学评分显著低于NS组，差异有统计学意义(P>0.05)。见表2。
4.RT—PCR结果：N组小鼠IL-10和HSP70呈高表达，饮用DSS后其表达逐渐下调。B组、L组和S组小鼠经益生菌治疗能上调其表达。TNF—a表达情况与之相反。GR的表达各组问差异无统计学意义(P>0.05)，实验期间无变化。见图2。
5.Western印迹检测结果：与NS组比较，B组、L组和S组小鼠IL一10和HSP70蛋白表达上调，TNF-a表达下调，GR蛋白无变化。见表3。
讨 论
UC是～种慢性非特异性结肠炎，目前治疗以水杨酸类和糖皮质激素类等药物为主。Pena等[6]使用Lactobacillus spp治疗IL一10-／-小鼠炎症性肠病(IBD)模型，能显著减轻肠道炎性反应。Cui等[7]给UC患者口服益生菌胶囊，粪便中嗜酸乳杆菌和青春双歧杆菌数量大为增加，2个月后复发率明显低于安慰剂组。然而并非所有肠道内的共栖益生菌都能治疗UC。Sehultz等[8]发现，E．coli Nissle1917对于急性UC小鼠没有治疗作用。Kokesova等[9]观察到，应用不同的益生菌治疗UC所获效果不完全相同，L．casei DN 114001在缓解实验动物体重降低和组织损伤方面效果更好，而E coli 083和E coli Nissle 1917调节肠道免疫功能效果更佳。
本研究给予DSS诱导的实验性结肠炎小鼠青春双歧杆菌BF0624或嗜酸乳酸杆菌LT0637，结果发现此两菌株均具治疗作用，其疗效与SASP相似，尤其嗜酸乳酸杆果优于L．casei[10]。不同益生菌在结肠的定植能力、产生的代谢产物及对有害物质的分解能力等均存在差异，这可能是益生菌疗效存在差异的原因。肠道内菌群组成复杂，不同肠段优势菌群不同，嗜酸乳杆菌是结肠的主要栖生菌，补充嗜酸乳杆菌能使结肠更接近于正常的微生物稳态，这可能是嗜酸乳杆菌疗效优于青春双歧杆菌BF0624和SASP的原因。本研究还发现，实验动物症状好转早于组织学改善，与Shen等[11]的研究结果相似。
有研究显示，肠道益生菌与黏膜免疫关系密切[1 21。本研究测定肠道促炎因子TNF-a和抑炎因子IL-10的表达变化，结果发现经益生菌或SASP治疗后5 d，IL-10表达上调，TNF-a表达下调。Joshi等[13]研究发现，氨基水杨酸类药物对于肠道自由基活性的清除作用可能是其治疗IBD的主要药理机制。Duncker等[14]的研究显示，益生菌不能影响正常小猪肠黏膜的免疫功能。HSP是一类高度保守的细胞应激蛋白，在炎性反应情况下可发生表达异常，其中HSP70与UC关系密切，其可与胞质中的GR结合组成复合体，有利于糖皮质激素与GR结合形成复合物进入细胞核Ds]。本研究显示，青春双歧杆菌BF0624或嗜酸乳酸杆菌LT0637可增强HSP70在小鼠肠黏膜中的转录和翻译，上调HSP70表达，而益生菌和SASP均不影响GR表达。证实青春双歧杆菌BF0624或嗜酸乳酸杆菌LT0637并非通过上调GR表达影响细胞因子转录，而是通过上调HSP70表达提高黏膜的保护作用；或者通过间接增强GR对糖皮质激素的亲和力发挥作用。
综上所述，青春双歧杆菌BF0624和嗜酸乳酸杆菌LT0637均对UC有治疗作用，其效果可达到或优于SASP，其治疗机制可能与上调HSP70和IL_10表达、抑制TNF-a的表达有关。
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(收稿日期：2008-01-13)
(本文编辑：杨学文)
本文转载于中华消化杂志2008年7月第28卷第7期Chin J Dig，July，2008，Vol.28，No.7
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